為了提高豆粕飼料的品質，采用3種益生菌協同中性蛋白酶固態發酵豆粕，并對其發酵工藝條件進行優化。結果顯示，枯草芽袍桿菌、嗜酸乳桿菌和產朊假絲酵母的最佳接種種齡為34 h，料水比為1：0.7，三種益生菌的添加比例為5：2：2加入0.1%中性蛋白酶與益生菌協同發酵，粗蛋白、酸溶蛋白和肽含量分別增加了20.25%、 26%和23.69%；發酵后的豆粕中抗原蛋白大幅度減少，游離氨基酸含量提高了13倍，豆粕的質量得到明顯改善。

豆粕是大豆榨油后獲得的副產品，其中不僅含有豐富的粗蛋白質，而且氨基酸組成多樣，符合畜禽對氨基酸的需求，因此，豆粕被大量用于飼用蛋白原料。但是大豆中存在多種抗營養因子，會影響機體對營養的吸收，直接飼喂導致蛋白質生物轉化率較低，這些抗營養因子限制豆粕在動物飼料中的應用；另外，豆粕中的過敏原蛋白也限制了豆粕在動物飼料中的應用。因此，需要將豆粕中大分子蛋白轉變成肽類物質和氨基酸等小分子物質，進而提高飼料蛋白的利用率。

目前，被廣泛采用處理豆粕的方法有酶解法和微生物發酵法。微生物發酵以豆粕為主要原料，使用細菌和真菌進行發酵，并經干燥制成的蛋白質飼料。用于發酵的菌種主要有細菌和真菌，細菌主要是乳酸菌類和芽孢桿菌類，真菌主要是酵母類和霉菌類。豆粕經發酵后，豆粕中的抗營養因子被大幅度減少，提高了動物消化吸收水平，并減少豆粕中其他營養成分的流失；而且微生物發酵產生的益生菌對動物腸道健康改善、降低抗生素使用等方面均有顯著效果。不同微生物對豆粕蛋白質有不同的水解能力，且單菌發酵能力普遍較低，多菌種固態發酵是一種有效提高豆粕蛋白質水解度的方式。酶解法利用蛋白酶將蛋白分解為多肽，產品具有肽類含量高、免疫活性強等特點，但易產生苦味物質，影響適口性。菌酶協同發酵即采用蛋白酶對豆粕進行處理，然后加入微生物進行發酵，避免單獨使用微生物發酵產酶不足的缺點，在發酵過程酵母菌和乳酸菌會產生多種香味物質和有機酸，不僅調節產品的苦味，改善飼料適口性，同時發酵后的豆粕具有抑菌能力，從而延長產品的保質期。

本研究采取菌酶協同發酵法制備豆粕飼料，選用了枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母和嗜酸乳桿菌作為發酵菌種，同時選用了中性蛋白酶對豆粕進行酶解，以發酵豆粕中肽和酸溶蛋白含量的變化為指標，優化了菌酶協同發酵豆粕的工藝。

1、材料與方法

1.1主要試劑和原料

豆粕、麥麩、玉米粉購自農貿市場，粉碎后過40目篩；中性蛋白酶≥200U/mg、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、牛肉膏、10% SDS、30% Acr-Bis、TEMED。

1.2菌種

枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌均為本實驗室保藏菌種。

1.3培養基

LB培養基：胰蛋白胨10 g.氯化鈉10 g、酵母粉5 g、蒸餾水1 L、YPD培養基：蛋白胨20g、酵母粉10 g、葡萄糖20g、蒸餾水1L。MRS培養基、蛋白胨l0g、牛肉膏8g、酵母粉4g、葡萄糖20g、檸檬酸三銨2g、CH3COONa5g、K2HP042g、MgS040.5g、MnSO40.2g、吐溫801mL、蒸餾水1L。

1.4儀器

K1305A型自動定氮儀；UV-2100紫外分光光度計；TG16-W微量臺式高速離心機；A300氨基酸自動分析儀。

1.5實驗方法

1.5.1種子的制備

將枯草芽孢桿菌接種于YPD液體培養基中，置于150r/min搖床，30℃培養34 h；嗜酸乳桿菌接種于MRS液體培養基，置于37℃恒溫培養箱培養34 h；產朊假絲酵母接種于YPD液體培養基，置于200 r/min搖床，28℃培養34 h。

1.5.2固態發酵豆粕

將豆粕、麥麩、玉米粉按90:5:5的比例分裝于500 mL燒杯中，115℃滅菌30 min，冷卻后，按5%接種量將種子液接入，加適量無菌水和糖蜜并攪拌均勻后，于37℃靜置培養發酵7天，每隔24 h取一次樣，樣品60℃烘干、粉碎后－20℃保存。

1.5.3菌體生物量和pH測定

取不同發酵時間的樣品1.0g，加50 mL蒸餾水，置于180r/min搖床中震蕩20 min，過濾，取上清液用pH計進行測定。

1.5.4發酵豆粕指標測定

粗蛋白和酸溶蛋白含量測定采用凱氏定氮法，分別參照GB/T 6432-2018飼料中粗蛋白的測定方法和GB/T 22492-2008大豆肽的測定方法；總游離氨基酸含量的測定采用茚三酮顯色法；多肽含量=酸溶蛋白含量－總游離氨基酸含量。

1.5.5感官評價

參照感官分析標準GB21172-2007和農業行業標準NYT 2218-2012，將適量樣品倒入干凈的平皿中，通過眼觀、鼻嗅、手捻等方法，分別評定樣品的顏色、氣味和質地。具體標準見表1。

1.5.6游離氨基酸分析

樣品處理步驟參考NY/T1975-2010，采用氨基酸自動分析儀，根據全自動氨基酸分析儀A300操作步驟進行。

2.2最適料水比的確定

基質含水量影響培養系統中的氧氣供應、氣體流動等，是關系到發酵成敗的制約因素。根據豆粕發酵的感官評價表，不同料水比下的發酵情況得分見表2，結果顯示料水比為1:0.7和1:0.8發酵效果無明顯差異。當培養基中的水分過低會導致氧氣不足，營養也不能很好地溶于水中，導致其利用率降低；而水分太多會導致基質多孔性降低，不利于物料內熱量的散發和氧氣的傳遞，影響菌的生長和繁殖，且含水量過高也會增加后期的干燥成本。因此確定枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌發酵的最適料水比為1:0.7。

2.3優勢菌種的確定

測定料水比為1:0.7、接種量為5%、發酵時間為72h的枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌的粗蛋白含量，其結果如圖2所示，枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母和嗜酸乳桿菌經過72h發酵后粗蛋白含量分別增加了12.2%, 6.6%和3.2%，確定枯草芽孢桿菌為優勢菌株?？莶菅挎邨U菌在發酵中產生中性蛋白酶和堿性蛋白酶且酶活力較為強盛，發酵豆粕由弱酸性轉變為堿性；酵母菌在整個發酵過程中pH值變化范圍較小呈偏弱酸性；乳酸菌在發酵過程中可產生大量有機酸如乳酸、乙酸和丙酸等，且時間越長作用越明顯，這導致其pH值下降，但乳酸菌主要是利用碳水化合物通過生成的淀粉酶、纖維素酶等作用產酸及其他風味物質，而分泌的蛋白酶系比較少。

2.4混菌比例的確定

分別采用枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母和嗜酸乳桿菌之間比例為5:2:2、5:3:2、5:2:3，連續發酵7天，每隔24 h取一次樣，測定樣品中的粗蛋白、酸溶蛋白及肽含量的變化。由圖3可知，發酵過程中粗蛋白含量都是呈先上升后下降趨勢，在120 h達到最大值，比發酵前分別增加了19%、14.1%和13.1%。圖4和圖5顯示酸溶蛋白和肽含量在5:2:2最高，比發酵前分別增加了17.47%和15.86%。綜合考慮，三菌株間比例為5:2:2最好。

2.5菌酶協同發酵對豆粕品質的影響

在枯草芽孢桿菌：產朊假絲酵母：嗜酸乳桿菌=5:2:2的基礎上添加0.1%中性蛋白酶，探討菌酶聯合對豆粕發酵品質的影響。由圖6可知，發酵后粗蛋白、酸溶蛋白和肽含量分別增加了20.25 % , 26%和23.69%。菌酶聯合發酵與混菌發酵相比，粗蛋白、酸溶蛋白、肽含量分別提高了1.25%、8.53%和7.83%，菌酶聯合發酵后效果明顯。

2.6蛋白降解情況分析

因為豆粕中含有多種抗營養因子，導致動物消化不良和腸道微生物不平衡，其中抗原蛋白含量較多，豆粕中抗原蛋白主要由β－球蛋白（(7s）和大豆球蛋白（lls）組成，7S蛋白是由三個亞基a（約67 kD)、a '（約71kD)、β（約50 kD）組成，11S蛋白是由酸性亞基（約40kDa）和堿性亞基（約20 kDa）組成。從圖7可以看出，該豆粕中存在7S和11S蛋白，豆粕經過混菌發酵和菌酶協同發酵后，分子量約為97.2kD的蛋白含量提高，但是7S和11S在兩種發酵條件下都得到大幅度減少，其中混菌+中性蛋白酶的發酵效果較好。

2.7氨基酸含量變化分析

蛋白質中必需氨基酸含量的高低是衡量蛋白質品質好壞的重要指標之一。取發酵后的豆粕樣品為實驗組，發酵前的樣品為對照組，按照NY/T 1975-2010樣品處理對豆粕進行前處理，然后通過氨基酸自動分析儀對樣品中的氨基酸進行測定，結果如表3所示。發酵前檢測出11種氨基酸，含量為1.522 mg/100 mg，發酵后檢測出16種氨基酸，為21.886 mg/100 mg，游離氨基酸含量提高了13倍。        

3、討論

本試驗利用枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌固態發酵豆粕，并結合中性蛋白酶處理，對豆粕的發酵過程進行處理，優化了發酵工藝條件。菌酶協同發酵處理后，可有效提高豆粕粗蛋白含量、肽含量、酸溶蛋白和游離氨基酸含量，與未發酵豆粕相比，粗蛋白、酸溶蛋白和肽含量分別增加了20.25 %,26%和23.69%；而與混菌發酵相比，菌酶協同處理后粗蛋白、酸溶蛋白和肽含量分別提高了1.25%,8.53%和7.83%，菌酶聯合發酵豆粕效果顯著。

通過菌酶協同作用，使豆粕中大分子蛋白得到一定程度的降解，提高了豆粕中的小肽含量，小肽被分解為氨基酸、多肽和氨等小分子物質，并去除了多種抗營養因子，有利于畜禽對豆粕的消化和吸收；在發酵過程中，由于酵母菌和乳酸菌的作用，使豆粕具有香味和一定的酸度，避免了添加酶帶來的不適口感，改善了豆粕的適口性，具有刺激食欲和增強牲畜免疫能力的作用。在微生物發酵過程中，采用的乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌是益生菌，這些益生菌可以改善畜禽腸道的微生態環境，抑制牲畜腸道有害菌群的繁殖，維持腸道益生菌群平衡，降低牲畜腹瀉率。

通過蛋白酶的分解作用也能夠提高豆粕蛋白產生小肽物質，其中有些小肽具有較好的免疫活性，常用的有酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶等，其中中性蛋白酶價格便宜，且具有一定的脫苦作用，在飼料工業常作為酶解豆粕的酶制劑。目前，菌酶協同處理表現出了極大的優勢，也成為了關注熱點。張煌等（2018）通過菌酶協同發酵，能夠顯著改善豆粕的品質。周爽等（2016）利用枯草芽孢桿菌和中性蛋白酶協同發酵豆粕，發酵后的豆粕其小肽含量得到大幅度提高。目前采用單菌種協同酶處理的發酵研究較多，但混菌發酵可以彌補單菌發酵的不足，能夠更好地提高豆粕的營養和降低生長抑制因子。本研究主要集中在混菌發酵和中性蛋白酶聯合處理工藝的研究，后續可以采用其他蛋白酶聯合處理，并篩選出最佳的發酵溫度、PH、接種量等工藝參數，從而獲得更好的豆粕發酵工藝。

實戰操作技術——棉菜籽餅脫毒變身優質飼料替代豆粕操作新技術

當前豆粕價格很高有些地方貨源緊缺，而棉菜籽餅（棉籽粕、菜籽粕）價格相對便宜，棉菜籽餅是棉子、油菜籽榨油后剩下的餅狀殘渣，蛋白質含量較高，含有各種氨基酸成分。但由于棉菜籽餅中含有植酸、芥子堿等物質，這些物質含有一定的毒性，還會影響動物的消化吸收，不能大量使用，因此不建議直接飼喂給動物！

現在通過微生物飼料發酵劑的除毒脫毒技術，可以成功將菜籽餅變為優質添加飼料，直接按照1公斤發酵的棉菜籽餅（發酵前的重量）代替約0.85公斤豆粕進行使用。飼料發酵劑中的有益微生物，在發酵過程中分泌的代謝產物，可將棉菜籽餅中的毒性物質等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分對比

1.豆粕是一種高蛋白原料，無需脫毒即可用作飼料。其中蛋白質含量為40%-48%，賴氨酸含量為2.5%-3.0%，色氨酸含量為0.6%-0.7%，蛋氨酸含量為0.5%-0.7%。2020年11月12日報價每噸在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之間，特點是蛋氨酸含量高（僅次于芝麻餅、粕），賴氨酸含量亦高。而精氨酸含量低，是餅、粕飼料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低（淀粉含量低、菜籽殼難以消化利用）。礦物質中，鈣和磷的含量均高，硒和錳的含量亦高。特別是硒的含量是常用植物飼料中最高的。2020年11月12日報價每噸在2900元左右。

3.棉粕蛋白質含量一般為44.32%，僅次于豆粕的蛋白質含量48%，而高于菜籽粕的蛋白質含量36.04%。精氨酸含量高達3.6%-3.8%，而賴氨酸含量僅有1.3%-l.5%，只有豆粕的一半。2020年11月12日報價每噸在3000元左右。

是否需要脫毒處理

1.豆粕無需經過脫毒即可用作飼料。而且豆粕中富含蛋白質和多種氨基酸，在不需要額外加入動物性蛋白的情況下，僅豆粕中含有的蛋白質和氨基酸足以平衡家禽和豬的食譜，促進它們的營養吸收。只有當其他粕類單位蛋白成本遠低于豆粕時，豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、單寧、皂角苷等不良成分，其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身無毒，但在一定溫度和水分條件下，經過菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而產生異硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈類等有害物質。這些物質可引起甲狀腺腫大，從而造成動物生長速度下降，繁殖力減退。單寧則妨礙蛋白質的消化，降低適口性。而芥酸阻撓脂肪代謝，造成心臟脂肪蓄積及生長受到抑制。。使用前需進行一定的脫毒處理，并且使用時要加以限制，具體喂量應根據菜粕中有害成分含量而定。經過脫毒處理的菜籽粕喂量可以加大，而“雙低”油菜籽生產的菜粕喂量要受限制。同時，應結合菜粕的氨基酸組成特點，適當搭配其它餅粕。

3.棉籽中含有對動物有害的棉酚及環丙烯脂肪酸，尤其是棉酚的危害很大。在制油過程中，由于蒸炒，壓榨等熱作用，大部分棉酚與蛋白質、氨基酸結合而變成結合棉酚，結合棉酚在動物消化道內不被動物吸收，故毒性很小。另一部分棉酚則以游離形式存在于餅、粕及油品中，這部分游離棉酚對動物毒性較大，尤其單胃動物過量攝取或攝取時間較長，可導致生長遲緩、繁殖性能及生產性能下降，甚至導致死亡。幼小動物對棉酚的耐受能力更低。由于棉籽餅、粕中游離棉酚對動物有害，因此，在使用棉餅、粕時，要根據飼喂對象及餅粕中游離棉酚的含量加以限量。反芻家畜在有優質粗料及多汁青料的情況下，棉籽餅、粕的用量不受限制，不會造成中毒。對單胃動物要限制喂量，最好使用經過脫毒處理的棉籽餅粕。同時，使用棉籽餅、粕配制飼糧要注意氨基酸平衡，尤其是棉籽餅、粕的賴氨酸含量低，且利用率差，應注意添加賴氨酸。

發酵操作技術

發酵棉菜籽餅其實也是一個脫毒技術，具體操作如下：

1.仔細檢查棉菜籽餅，剔除棉菜籽餅中嚴重變質發霉的部分，輕度發霉的原料可以忽略，因為微生物發酵能夠脫霉。

2.將棉菜籽餅粉碎并添加適量的玉米粉淀粉類的能量飼料等，調節飼料營養比例。

3.每噸棉菜籽餅加入2公斤食鹽、玉米粉（其它淀粉、面粉次粉等也可以，或者粉碎的生紅薯300公斤也可以）100公斤、“99多功能飼料發酵劑”1包（500g/包，市場售價約25元，以高濃度乳酸菌、酵母菌、復合酶制劑的專業發酵劑）。

4.在混合物料中添加適量水分，使混合物料含水量保持在55%左右，以“手抓一把并緊握，無水滴落，松手后輕觸即散”為宜，一般上述配方中需要加入清水約500-600公斤。

5.發酵方式根據實際環境條件各異，在桶、缸、塑料袋等容器中發酵均可。

6.發酵時要盡可能排盡空氣進行密封發酵。如果使用的發酵容器有密封不嚴實的隱患，要在一開始就在其外層包裹一層塑料袋并扎緊。發酵過程中不能啟封。

7.發酵時間受環境溫度影響，通常夏季發酵2-3天，冬季發酵5-7天即可完成。發酵完成后，有較為強烈的酸香味，ph值在3-4。

規模運用混合發酵現場

塑料缸、飼料袋（有內膜）均可做發酵飼料

采用池子發酵

發酵完成的棉菜粕飼喂動物技術

需要注意的是，發酵后的飼料酸度較低，不可以取代禽畜全部日糧。其他類發酵飼料同理。飼喂時根據不同情況，將發酵飼料按照一定比例添加到日糧中，發酵完成的棉菜粕為濕料，具體使用量每大概1.5-2公斤發酵棉菜粕（濕料）代替動物日糧配方中1公斤豆粕的使用量進行代替使用，與其它飼料混合后直接飼喂，由于棉菜籽粕蛋白較高，最高使用量不要超過禽畜日糧飼喂量的40%（濕料重量）。如果發現發酵飼料過酸適口性變差，可在飼喂前在陽光下曬1-2小時，或添加適量的碳酸氫鈉（小蘇打）即可改善。

發酵過程中與發酵后使用過程中，發酵的容器要一直保持密封狀態，可以長時間保存（一年左右）。

當前養殖業成本高居不下，而飼料成本是其中最高的，利用廉價原料發酵飼料（包括一些輕度發霉的粕類低價收回）是極佳解決辦法。通過微生物飼料發酵劑的發酵作用，可以將輕度霉變飼料變成優質飼料，將不易消化的物質分解為可被畜禽吸收的小分子糖類、氨基酸等。同時發酵飼料中富含有益微生物、酶制劑、酸化劑等，可調節畜禽腸胃微生態環境并進一步提高飼料利用率。發酵飼料氣味清香，提高了飼料的適口性，加上發酵飼料中有大約4℃的酒度，能夠促進動物新陳代謝促進健康抵御疾病，是當前養殖業發展中重要的一環。

本技術也可以同樣發酵菜籽粕（餅）、棕櫚粕等，方法同上。

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