菌酶協同發酵飼糧對仔豬生長性能、養分消化率、血清生化指標和腸道屏障功能的影響

2020-12-30 09:01:53 點擊：

摘要：本試驗旨在探究菌酶協同發酵飼糧對仔豬生長性能、養分消化率、血清生化指標和腸道屏障功能的影響。試驗選取96頭42日齡(8.99±0.75)kg“杜×長×大”雜交仔豬,按體重一致原則隨機分為對照組(CON組,基礎飼糧)抗生素組(AB組,基礎飼糧＋75mg/kg金霉素)、12h發酵組(12h FER組,12h發酵飼糧)和24h發酵組(24h FER組,24h發酵飼糧),每個組8個重復,每個重復3頭豬,試驗期21d。結果表明與CON組相比,12h FER組和24h FER組仔豬平均日增重(ADG)均顯著提高(P<0.05),料重比(F/G)和腹瀉率顯著降低(P<0.05);與AB組相比,24h FER組仔豬ADG顯著提高(P

仔豬斷奶后，生長緩慢、腹瀉率高、腸道屏障功能減弱等問題嚴重制約豬養殖行業的發展。因此，提高仔豬斷奶期的生長性能和改善其腸道健康是養豬行業發展的重中之重。發酵飼料因具有綠色、安全、廉價易得等優點，同時可促進仔豬生長、緩解腹瀉，引發人們廣泛關注。研究表明，飼喂發酵豆粕可提高仔豬平均日增重（average dailygain，ADG），顯著降低料重比（feed/gain，F/G）。飼喂發酵大豆蛋白可提高仔豬ADG和降低F/G，且ADG與發酵大豆蛋白的添加量呈線性正相關。Kiers等研究也發現，飼糧中添加20%由根霉和枯草芽孢桿菌聯合發酵的大豆可促進仔豬生長，顯著降低仔豬腹瀉率。此外，越來越多的研究表明，添加酶制劑可提高微生物發酵的效率。在發酵過程中，菌和酶能起到很好的協同作用，酶制劑的使用可提高發酵效率、縮短發酵時間，菌酶協同使用的效果要優于菌和酶單獨使用時的效果。研究表明，菌酶協同處理的豆粕粗蛋白質（CP）含量由47.62%提高到56.72%，特定的菌酶協同發酵可以提高飼糧中乳酸含量，降低飼料pH，但有關菌酶協同發酵飼糧在仔豬上的應用及其對仔豬腸道健康的影響的研究還較少。因此，本研究旨在探究菌酶協同發酵飼糧對仔豬生長性能、養分消化率、血清生化指標和腸道屏障功能的影響，為菌酶協同發酵飼糧在仔豬上的應用提供理論支撐，為減少抗生素的使用和仔豬健康養殖提供科學資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種購自中國普通微生物保藏中心，且符合《飼料添加劑品種目錄（2013）》規定。復合酶制劑來自于北京昕大洋懷安科技發展有限公司。MRS瓊脂培養基、MRS肉湯培養基、馬鈴薯葡萄糖（PDA）瓊脂培養基、乳桿菌選擇性（LBS）瓊脂培養基和麥康凱瓊脂培養基購自北京奧博星生物技術有限責任公司。發酵桶購自廣州博善生物科技股份有限公司。

1.2 試驗設計

試驗選擇96頭42日齡健康的“杜×長×大”雜交豬，按體重［（8.99±0.75）kg］相近原則隨機分為4組：對照組（CON組，基礎飼糧）、抗生素組（AB組，基礎飼糧＋75mg/kg金霉素）、12h發酵組（12h FER組，12h發酵飼糧）和24h發酵組（24hFER組，24h發酵飼糧），每組8個重復，每個重復3頭豬，試驗期21d。

1.3 試驗飼糧

參照NRC（2012）仔豬營養需要配制玉米-豆粕型基礎飼糧（粉狀），基礎飼糧組成及營養水平見表1。發酵飼糧各原料組成比例與基礎飼糧一致，發酵工藝參照專利（專利號：201910736307.0）。在底物中加入水、酶制劑并接種微生物于發酵桶中攪拌均勻后在26～30℃條件下分別密封發酵12和24h。發酵完成后，按飼糧配方加入除底物以外的其他原料，混合均勻后用以飼喂。

1.4 飼養管理

試驗在四川農業大學科研基地進行。試驗前沖洗試驗場地，并全面消毒、密閉熏蒸（甲醛：高錳酸鉀=2：1）。仔豬自由采食和飲水，其他管理按照試驗基地規定進行。每天記錄豬的精神狀態、腹瀉狀況和采食量。

1.5 指標測定

1.5.1 生長性能

于試驗第1天和第22天早上對經空腹處理的試驗仔豬稱重，計算ADG；每日記錄采食量，用以計算平均日采食量（ADFI），并根據采食量和增重計算F/G。腹瀉率：每天早晚喂料期間仔細觀察糞便情況，并對每個重復的腹瀉頭次和評分進行詳細的記錄。當腹瀉評分大于或等于2時，判定該仔豬發生腹瀉，評分標準見表2。腹瀉率計算參照廖波等。計算公式如下：

腹瀉率=［腹瀉仔豬頭數/（仔豬頭數×試驗天數）］×100。

1.5.2 養分消化率

飼糧樣品采用四分法收集，每個組取500g左右，發酵飼糧每日取約100g裝入樣品袋并記號，-20℃保存。試驗結束后，將每日的發酵飼糧混合均勻，用于測定總能（GE）以及干物質（DM）、粗灰分、CP、粗脂肪（EE）和總磷（TP）的含量。糞便采用全收糞法，以重復為單位，收集每個重復試驗第18～21天排出的全部糞便，每次收集的糞便稱重后，按每100g加10%硫酸（H2SO4）10mL進行固氮處理滴加數滴甲苯防腐，混勻糞樣，-20℃保存。試驗結束后，將每個重復的所有糞樣攪拌混合均勻后，置于65℃烘箱干燥，粉碎，待測。飼糧和糞便中養分含量測定參照張麗英的方法。養分消化率以鹽酸不溶灰分為指示劑（測定方法參照GB/T 23742-2009）進行計算，計算公式如下：

某養分消化率（%）=（1-（A1×F2）/（A2×F1））×100。

式中：F1和F2分別代表飼糧和糞便中該養分含量（%）；A1和A2分別代表飼糧和糞便中鹽酸不溶灰分含量（%）。

1.5.3 血清生化指標

試驗第22天，仔豬空腹稱重后，用真空采血管于前腔靜脈采血，室溫下靜止放置30min，然后3500r/min離心10min分離血清，-20℃保存，待測血清指標。血清中總蛋白（TPROT）、尿素氮（UREA）、白蛋白（ALB）、葡萄糖（GLU）含量和堿性磷酸酶（ALP）活性均采用試劑盒（瑞士羅氏公司）由全自動血清生化儀（HITACHI，日本）測定。血清二胺氧化酶（DAO）活性采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（北京誠林生物科技有限公司），按照說明書進行測定。

1.5.4 空腸黏膜消化酶活性

測定之前腸道黏膜樣品進行勻漿，稱取一定量（0.3～0.5g）的黏膜樣品，按質量體積比1：9（g/mL）加入生理鹽水，進行超聲粉碎勻漿，3500r/min離心10min，取上清液，制成10%勻漿液，-20℃保存待測?？漳c黏膜蔗糖酶、麥芽糖酶、乳糖酶和淀粉酶活性采用試劑盒（南京建成生物工程研究所），按照說明書進行測定。

1.5.5 小腸形態和杯狀細胞

用4%多聚甲醛將腸道組織固定，然后經脫水、包埋、切片和染色等標準操作程序處理后，用光學顯微鏡鏡檢并拍照，每個樣品選取10個走向平直且形態完整的絨毛和隱窩進行測定，并取相應絨毛上的杯狀細胞計數。測定參照廖波等的方法。

1.5.6 腸道屏障相關基因mRNA的相對表達量

采用實時熒光定量PCR測定空腸和回腸閉合小環蛋白-1（ZO-1）、閉合小環蛋白-2（ZO-2）、黏蛋白2（MUC2）、密閉蛋白（OCLN）和封閉蛋白-1（CLDN-1）mRNA相對表達量?？俁NA的提取按照試劑盒（TrizolReagent，TaKaRa，日本）操作說明進行，RNA質量檢測使用核酸蛋白檢測儀（BeckmanDU-800，CA，美國）于260nm檢測，A260/A280表示RNA的純度，該比值在1.8～ 2.0說明RNA純度較好。cDNA的合成按照逆轉錄試劑盒（PrimeScriptTM Regent Kit，TaKaRa，日本），反應結束后-20℃保存待用。利用美國國家生物技術信息中心（NCBI）搜索基因序列，運用Primer 5進行引物設計，由上海生工生物工程公司合成，引物序列見表3。用實時熒光定量PCR儀（ABI 7900HT real-time PCR System，ABI，美國）進行測定，反應熒光染料為SYBR Green I（TaKaRa，日本）。反應體系為10.0μL：5.0μL SYBR Premix Ex TaqTM（2×）、0.5μL 上游引物、0.5μL下游引物、3.0μL雙蒸水和1.0μL cDNA模板。選擇β-肌動蛋白作為空腸和回腸黏膜的內參基因，使用2-ΔΔCt方法計算目的基因相對表達量。

1.6 數據統計分析

試驗數據用Excel 2010進行初步整理與計算，然后用SPSS 20.0進行單因素方差分析，并結合Duncan氏法進行多重比較，以P<0.05為差異顯著判斷標準，結果以平均值和集合標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 發酵飼糧對仔豬生長性能的影響

如表4所示，與CON組相比，12hFER組和24hFER組組仔豬ADG均顯著提高（P<0.05），腹瀉率和F/G顯著降低（P

2.2 發酵飼糧對仔豬養分消化率的影響

如圖1所示，與CON組和AB組相比，12h FER組和24hFER組DM、CP、EE、Ash、GE和TP的消化率均顯著提高（P

2.3 發酵飼糧對仔豬血清生化指標的影響

如表5所示，與CON組相比，24hFER組仔豬血清中DAO活性顯著降低（P

2.4 發酵飼糧對仔豬空腸黏膜消化酶活性的影響

如表6所示，與CON組相比，AB組和24h FER組仔豬空腸蔗糖酶活性均顯著提高（P<0.05）；與12h FER組相比，24hFER組仔豬空腸蔗糖酶活性顯著提高（P

2.5 發酵飼糧對仔豬小腸形態和杯狀細胞數量的影響

如表7所示，在十二指腸中，與CON組相比，12hFER組和24h FER組仔豬絨毛高度/隱窩深度（絨隱比）顯著提高（P<0.05），12hFER組仔豬隱窩深度顯著降低（P<0.05）；與AB組相比，12hFER組仔豬絨隱比顯著提高（P<0.05），隱窩深度顯著降低（P<0.05）。在空腸中，與CON組相比，24hFER組仔豬隱窩深度顯著降低（P<0.05），12h FER組仔豬空腸杯狀細胞數量顯著升高（P<0.05）；與AB組相比，12hFER 組仔豬空腸杯狀細胞數量顯著升高（P<0.05）。在回腸中，與CON組和AB組相比，12h FER 組和24h FER組仔豬空腸絨毛高度顯著提高（P

2.6 發酵飼糧對仔豬空腸和回腸緊密連接蛋白相關基因表達的影響

如圖2所示，在空腸中，24hFER組仔豬空腸CLDN-1和ZO-1基因的mRNA相對表達量顯著高于其他3組（P<0.05）。在回腸中，與CON組和AB組相比，12hFER組和24hFER組仔豬OCLN基因的mRNA相對表達量顯著升高（P<0.05）

3 討論

研究表明，飼料經發酵或者添加酶制劑均可以緩解仔豬腹瀉，提高飼料利用率，改善仔豬生長性能。Chang等研究指出，乳酸菌發酵飼糧能顯著提高仔豬ADG和養分消化率。Wang等在飼糧中添加24%發酵豆粕，結果顯示，發酵豆粕顯著提高了仔豬ADG，同時降低了F/G。本試驗研究發現，2組菌酶協同發酵飼糧均能顯著提高仔豬ADG，顯著降低F/G，并有效緩解仔豬腹瀉，其腹瀉率分別降至6.55%和8.53%，與上述研究結果相似。這可能是由于菌酶協同發酵飼糧中含有大量有活性的乳酸菌，一方面，乳酸菌的增殖可產生大量的乳酸，降低飼糧pH，從而使易引起仔豬腹瀉的大腸桿菌數量大幅減少，仔豬腹瀉率降低，從而減少了營養物質的流失；另一方面，研究發現，菌酶協同發酵提高了飼糧的可消化性，菌酶協同發酵兼具發酵和酶解的功能，不僅能縮短發酵周期，提高發酵效率，還能有效提高飼料的酶解程度，經酶解后的飼糧更易于被仔豬的消化和吸收。此外，各試驗組仔豬ADFI無顯著差異，但2個發酵組ADFI比對照組高50～70g/d。分析其原因，可能有以下2點：1）飼料經乳酸菌發酵后產生的乳酸等有機酸使飼糧具有酸香味，且適口性有所增強，從而促進動物的采食；2）仔豬采食發酵飼糧時，大量益生菌隨之進入仔豬腸道內，有益菌群在腸道內定植后利用微生物產生的代謝產物，幫助機體分解食物并促進消化吸收，有利于促進仔豬采食。動物的生長性能與消化性能密切相關，即動物對飼糧中的養分消化率越高，其生長性能越好。本試驗中，12h FER組和24h FER組DM、CP、EE、Ash、GE和TP消化率顯著提高，這說明12和24h發酵可提高仔豬對營養物質的利用率，進而改善仔豬生長性能。

血清中ALB、TPROT含量能夠反映機體的新陳代謝功能，血清中DAO活性是反映腸道功能的重要指標之一。其中ALB合成于肝臟，具有清除自由基、抗凝血等生理功能。本研究的結果顯示，24hFER組仔豬血清DAO活性顯著低于其他組，2個發酵組血清ALB含量與CON組相比有提高的趨勢，表明24hFER組仔豬的腸道功能得以增強，同時，12h FER組和24hFER組仔豬的代謝狀況可在一定程度上改善。

空腸內含有大量消化酶，如淀粉酶、蔗糖酶等，是仔豬對營養物質進行消化和吸收的重要場所。消化酶的活性可受多種因素影響，如飼糧的種類、外源性激素、抗營養因子和動物的年齡等。馮尚連等研究表明，乳酸可以提高仔豬空腸二糖酶活性。本試驗研究結果表明，24hFER組仔豬空腸蔗糖酶活性顯著高于對照組，12h FER組蔗糖酶活性比對照組高39.04%。所以，可能是發酵飼糧中乳酸提高了蔗糖酶的活性。

小腸的絨毛高度和隱窩深度及絨隱比是反映腸道通透性、吸收性和腸道黏膜功能是否完善的重要指標。魏小兵等研究表明，無抗發酵飼糧組仔豬空腸和回腸絨毛高度顯著升高，隱窩深度降低，絨隱比顯著提高，杯狀細胞數量顯著增加。張俊等在肉雞上的研究也得到相似的結果。本試驗結果表明，與CON組相比，12h FER組仔豬十二指腸隱窩深度顯著降低，十二指腸絨隱比和回腸絨毛高度顯著提高，空腸杯狀細胞數量顯著增加，與前人研究結果基本一致。這表明本試驗所采用的菌酶協同發酵飼糧能夠促進仔豬小腸的生長發育，改善仔豬腸道組織形態，保障腸道黏膜的完整性，這與生長性能和養分消化率的結果相對應，說明12和24h發酵可能是通過促進腸道組織結構的發育來促進仔豬對營養物質的消化與利用，進而促進仔豬生長。

有研究指出，腸道上皮細胞是腸道機械屏障發揮功能的關鍵。OCLN、CLDN-1、ZO-1、ZO-2等緊密連接蛋白是連接腸上皮細胞的重要組分。研究發現，OCLN和CLDN-1可以通過影響緊密連接，影響上皮細胞的通透性及腸道屏障功能。Woo等研究了發酵大麥和豆粕混合飼糧對葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）致炎的小鼠腸道屏障功能的作用，結果發現發酵大麥和豆粕混合物顯著上調了小鼠結腸中OCLN、CLDN-1和ZO-1的基因表達量。張俊等的研究結果表明，益生菌發酵飼糧可以顯著提高肉雞回腸中封閉蛋白-3（CLDN-3）和ZO-1基因的表達量。本試驗研究結果表明，24h FER組仔豬空腸黏膜CLDN-1和ZO-1基因的相對表達量顯著上調，12hFER組和24h FER組仔豬回腸OCLN基因相對表達量顯著上調，與小腸組織形態結果相對應，說明飼喂12和24h發酵飼糧能提高仔豬腸道絨毛高度和絨隱比，上調CLDN-1、ZO-1和CLDN基因的表達，維持小腸組織的完整性和選擇通透性，增強腸道的機械屏障功能。腸道黏膜表面覆蓋有黏液，黏液層是腸道內共生菌的主要棲息場所，是腸道重要的化學屏障，具有保護腸道，使其免受機械損傷的作用。杯狀細胞可分泌黏蛋白，對維持腸道黏膜健康起重要作用。有研究表明，乳酸菌可通過調節杯狀細胞影響腸道的屏障功能。本試驗結果表明，與對照組相比，12h發酵飼糧可顯著提高空腸杯狀細胞數量，回腸杯狀細胞數量提高46.53%，與前人研究結果一致。所以，可能是發酵飼糧中乳酸菌促進了杯狀細胞的增殖。

4 結論

本試驗表明，發酵飼糧可改善腸道健康，提高養分消化率，降低腹瀉率，從而提高仔豬生長性能，發酵飼量效果相當于或優于金霉素，發酵12與24h飼糧效果相當。

生物發酵飼料的制作方法

生物發酵飼料不是什么高大上的東西，只要有專業的飼料發酵劑+原料就可以自己制作。所需的材料和設備都要求不高，具體做法是：

1.按照配方分別稱取原料（參考配方1：玉米50%、豆粕或菜粕50%；參考配方2：60%全價配合飼料、豆粕40%；參考配方3:100%的豬雞鴨全價飼料。配方中蛋白飼料越多效果越好。

2.選用含復合菌+復合酶制劑組合的酶菌結合飼料發酵劑，特別推薦選用“99多功能飼料發酵劑”這個發酵劑，500克/包，市場售價僅25元，發酵1-2噸飼料，使用量越大效果越好，菌種品種和數量多，且含豐富酶制劑分解飼料中的粗纖維效果好，且發酵完成的飼料香甜味和適口性更好。

3.將菌種溶于溫水中半小時以上，加入少量紅糖或糖蜜效果更好，然后均勻噴灑在發酵料中，邊拌邊灑，使發酵料的含水量達到手捏成團、落地即散的程度，一般料含水量55%-60%比較好。

4.將拌好的發酵飼料裝于塑料桶或陶瓷缸中或水泥池內，稍將料壓實后密封讓其自然發酵。一般氣溫在25℃以下時，發酵時間為7--10天，氣溫在25℃以上時，則為3--5天。

5.發酵后，pH值達到4--5以下，并有濃郁的酒香味，即為發酵成功。

發酵飼料制作現場

99多功能飼料發酵劑——高濃度乳酸菌為主的固態飼料發酵劑，更輕易成功、效果更好的生物飼料發酵劑，簡單好用的中草藥發酵劑

【視頻】部分發酵飼料養豬雞鴨帶給你無臭味健康無抗養殖效果

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